【佳學(xué)基因檢測(cè)】少汗型外胚層發(fā)育不良（HED）基因檢測(cè)案例介紹

少汗型外胚層發(fā)育不良患者為什么存在牙缺失？

牙缺失（Tooth Agenesis, TA）根據(jù)是否伴有多種臨床綜合征可分為非綜合征型（Nonsyndromic）和綜合征型（Syndromic）。其中，非綜合征型牙缺失（NSTA）是最常見的類型，僅表現(xiàn)為單一性狀，僅影響牙齒的發(fā)育。流行病學(xué)基因解碼顯示，NSTA在人群中的發(fā)病率在不同國(guó)家和種族中介于2.6%至11.3%之間。

在非綜合征型牙缺失（NSTA）的病因?qū)W基因解碼中，發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因與其密切相關(guān)，其中MSX1、PAX9、AXIN2、WNT10A、WNT10B、LRP6和EDA被頻繁提及。位于第2號(hào)染色體長(zhǎng)臂（2q35）上的WNT10A基因被認(rèn)為是主要的致病基因之一，約占NSTA病例的50%。

另一方面，牙缺失也可能是更復(fù)雜的綜合征表現(xiàn)的一部分，即綜合征型牙缺失，例如外胚層發(fā)育不良（Ectodermal Dysplasias, EDs）。EDs可分為11個(gè)臨床亞型，其中低汗性外胚層發(fā)育不良（HED）是最常見的類型之一，其典型表現(xiàn)包括少牙/缺牙、少汗/無(wú)汗和毛發(fā)稀疏。

低汗性外胚層發(fā)育不良（HED）還可能伴有其他畸形特征，如：額頭突出、眼部黑圈、鞍鼻、嘴唇外翻、眼周色素沉著、瞼板腺異常，甚至偶見乳頭缺失。目前已知有4個(gè)基因約占90%的HED發(fā)病病例，包括EDA、EDAR、EDARADD和WNT10A。其中，大多數(shù)低汗性外胚層發(fā)育不良（HED）病例是EDA基因（位于Xq12-q13.1）的變異或缺失所致，屬于X連鎖遺傳。

WNT10A基因也被證實(shí)可導(dǎo)致某些常染色體隱性遺傳的ED類型，如指甲-牙齒-皮膚發(fā)育不良（OODD）和Schöpf-Schulz-Passarge綜合征。更有基因解碼表明，WNT10A基因的變異亦可導(dǎo)致HED。

與由EDA基因變異引起的低汗性外胚層發(fā)育不良（HED）相比，由WNT10A變異導(dǎo)致的HED臨床表型相對(duì)較輕，表現(xiàn)為毛發(fā)和汗腺異常，但不伴有面部畸形。此外，約10%的HED病例則由其他較罕見的基因變異引起，如NFKBIA[24–26]和NEMO/IKBKG。

盡管目前已確認(rèn)WNT10A在部分低汗性外胚層發(fā)育不良（HED）病例中的致病作用，其具體的分子機(jī)制及所涉及的信號(hào)通路通過基因解碼正變得格外明晰。此外，低汗性外胚層發(fā)育不良（HED）患者中牙齒缺失的數(shù)量與分布位置與相關(guān)致病基因之間的關(guān)系也通過基因解碼得到解析。

低汗性外胚層發(fā)育不良（HED）病例介紹

兩名分別為11歲和8歲的親兄弟因先天性牙齒缺失被轉(zhuǎn)診至同佳學(xué)基因具有合作關(guān)系的武漢大學(xué)口腔中心就診。經(jīng)患兒母親及兩名患兒本人簽署知情同意書后，醫(yī)護(hù)人員收集了兩位患兒的病史資料，拍攝了相關(guān)臨床照片，并采集了外周靜脈血樣本外送到佳學(xué)基因檢測(cè)進(jìn)行致病基因鑒定基因解碼分析。這對(duì)兄弟被診斷為低汗性外胚層發(fā)育不良（HED），均表現(xiàn)出典型的臨床特征，包括少牙（hypodontia）、毛發(fā)稀疏（hypotrichosis）、少汗（hypohidrosis）以及面部發(fā)育異常（facial dysmorphism）。有趣的是，哥哥的牙齒發(fā)育不全明顯比弟弟更為嚴(yán)重。哥哥下頜完全無(wú)牙，僅保留上頜兩顆中切牙；而弟弟則仍有部分前牙萌出。

體格檢查顯示，這對(duì)兄弟均表現(xiàn)出頭發(fā)稀疏、牙齒缺失及汗腺發(fā)育不良（圖1a-d）。兩人均具有X連鎖低汗性外胚層發(fā)育不良（HED）的典型面容特征：鞍鼻、嘴唇厚大、下頜尖翹以及眼周黑眼圈。

口腔檢查及錐形束CT（CBCT）掃描結(jié)果提示，哥哥（II-1）的所有乳牙及大多數(shù)恒牙均先天缺失，僅保留兩顆錐形上中切牙（#11、21）（圖1a-b）。由于下頜牙列完全缺失，他無(wú)法正常咀嚼或建立咬合關(guān)系。

弟弟（II-2）尚保留6顆乳牙（#51、53、61、63、73、83）及3顆恒牙胚（#11、21、43）（圖1c-d）。

結(jié)合全身癥狀和口腔表現(xiàn)，最終確認(rèn)兩位患兒均診斷為HED。

圖1：HED兄弟患者的牙齒特征與面部表現(xiàn)

a-b：**兄長(zhǎng)（II-1）**的口腔狀況及全景X線片。
c-d：弟弟（II-2）的口腔狀況及全景X線片。
e：家系圖，黑色方塊代表HED患者。
f：DNA測(cè)序圖譜顯示兩位兄弟（II-1，II-2）攜帶EDA基因雜合變異c.878T>G（p.L293R）。
g-h：兄長(zhǎng)（II-1）同時(shí)攜帶兩個(gè)WNT10A基因雜合變異：c.511C>T（p.R171C）和 c.637G>A（p.G213S）。

佳學(xué)基因如何進(jìn)行基因解碼基因檢測(cè)？

全外顯子組測(cè)序（WES）及結(jié)果分析

DNA樣本由佳學(xué)基因醫(yī)學(xué)技術(shù)（北京）有限公司進(jìn)行提取及WES測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，基因解碼師首先從三大數(shù)據(jù)庫(kù)（1000 Genomes，Exome Aggregation Consortium，Genome Aggregation Database）中篩除次要等位基因頻率（MAF）大于0.05的變異，這些數(shù)據(jù)庫(kù)均包含與患者人群相似的東亞健康個(gè)體的參考數(shù)據(jù)。接著，佳學(xué)基因解碼剔除同義突變，僅保留外顯子區(qū)域內(nèi)的非同義單核苷酸變異（SNV）及插入/缺失突變。

隨后，佳學(xué)基因解碼進(jìn)一步篩選出已在文獻(xiàn)中報(bào)道與牙齒缺失（TA）相關(guān)的55個(gè)基因中存在的變異。在此基礎(chǔ)上，按照以下工具的致病性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)篩選潛在致病變異：

1. SIFT 評(píng)分 ≤ 0.05

2. PolyPhen-2 評(píng)分 ≥ 0.909

3. CADD 評(píng)分 > 20

4. 符合 ACMG（美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)） 標(biāo)準(zhǔn)

這些標(biāo)準(zhǔn)用于識(shí)別可能與TA相關(guān)的致病性變異。

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Sanger測(cè)序驗(yàn)證

為驗(yàn)證WES結(jié)果，佳學(xué)基因檢測(cè)采用Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)EDA與WNT10A基因的相關(guān)片段進(jìn)行了測(cè)序?；颊呋蚪MDNA的提取使用了TIANamp血液DNA中量提取試劑盒（天根生化，北京），并按照產(chǎn)品說明進(jìn)行操作。針對(duì)變異位點(diǎn)所設(shè)計(jì)的特異性引物見表1。

使用Taq PCR Master Mix（百泰克，北京）進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。所得測(cè)序結(jié)果與參考序列（EDA: NM_001399；WNT10A: NM_025216，參考自UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)：https://genome.ucsc.edu/）進(jìn)行比對(duì)，以驗(yàn)證WES數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
 

致病基因鑒定基因檢測(cè)結(jié)果

在兩兄弟中均檢測(cè)到EDA基因c.878T>G（p.L293R）的錯(cuò)義變異，但復(fù)合雜合型WNT10A基因變異（c.511C>T（p.R171C）和c.637G>A（p.G213S））僅在兄長(zhǎng)中發(fā)現(xiàn)。

全外顯子組測(cè)序（WES）篩查顯示兄長(zhǎng)存在3個(gè)錯(cuò)義變異：EDA基因第7外顯子的c.878T>G（p.L293R），以及WNT10A基因第3外顯子的c.511C>T（p.R171C）和c.637G>A（p.G213S）。生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)這三個(gè)變異均具有致病性（表2）。這些變異位點(diǎn)已提交至ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/submitters/509028/）。其中WNT10A基因的c.511C>T和c.637G>A復(fù)合雜合變異被確認(rèn)為TA（缺牙癥）的致病突變。弟弟僅攜帶EDA基因的c.878T>G（p.L293R）錯(cuò)義變異。

母親臨床表型正常，未出現(xiàn)毛發(fā)、汗腺或牙齒相關(guān)異常。WES檢測(cè)顯示其為EDA基因c.878T>G雜合變異及WNT10A基因c.511C>T雜合變異的攜帶者。上述結(jié)果均經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證（圖1e-h）。

基因檢測(cè)結(jié)果解釋

HED 根據(jù)所涉及的基因表現(xiàn)出不同的遺傳方式，其中 X 連鎖EDA相關(guān)HED是該疾病最常見的形式。EDA位于 Xq12-q13 區(qū)域，該區(qū)域有多種亞型，主要介導(dǎo)表皮-間質(zhì)和細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。經(jīng)典的 EDA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分包括 EDA、 EDAR和 EDARDD，下游信號(hào)通路為 NF-κB 信號(hào)通路。EDA基因有 4 個(gè)重要的功能區(qū)： TM 、弗林蛋白酶切割、膠原樣結(jié)構(gòu)域（膠原）和 TNF 同源結(jié)構(gòu)域，其中后者是最常見的突變結(jié)構(gòu)。佳學(xué)基因檢測(cè)基因解碼中發(fā)現(xiàn)的 c.878 T > G 變異位于EDA基因的 TNF 同源結(jié)構(gòu)域。 TNF同源結(jié)構(gòu)域與受體（EDAR）結(jié)合形成自體三聚體。佳學(xué)基因檢測(cè)推測(cè)TNF同源結(jié)構(gòu)域的c.878 T > G變異阻止EDA與EDAR結(jié)合，從而影響EDA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致IκBα表達(dá)增加，而IκBα是抑制NF-κB活化的最重要成員通過抑制NF-κB的磷酸化、核轉(zhuǎn)錄和與DNA結(jié)合，而DNA結(jié)合是NF-κB信號(hào)通路的下游。NF-κB信號(hào)通路的失活導(dǎo)致外胚層來(lái)源的組織和器官發(fā)育缺陷。佳學(xué)基因檢測(cè)的結(jié)果與先前的基因解碼相似，在該基因解碼中，一名患有c.878 T > G變異的患者上頜僅剩下兩顆釘狀中切牙。

據(jù)基因檢測(cè)大數(shù)據(jù)分析，HED 中發(fā)現(xiàn)了較大的EDA變異，并且這些變異的表型各不相同。在本基因解碼中，佳學(xué)基因檢測(cè)總結(jié)了過去 5 年中由EDA變異引起的 HED 表型（表1）。佳學(xué)基因檢測(cè)通過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，43.14% (22/51) 的EDA變異位于 TNF 同源亞結(jié)構(gòu)域，這與以前的報(bào)告一致。不同EDA結(jié)構(gòu)域變異引起的缺失牙平均數(shù)大于 24 顆，且無(wú)顯著差異，這與本基因解碼中患者的表型一致。受影響的牙位置不同；上頜中切牙受影響最少，保留率為 0.538（14/26，#11 和 #21），其次是左上頜第一磨牙，保留率為 0.385（10/26，#26）（圖2b）。c.457C > T變異患者均保留了上下第一磨牙，而c.164 T > C變異患者保留了上頜中切牙。此外，佳學(xué)基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相同EDA變異的患者在缺失牙表型上存在差異，這可能是由表觀遺傳學(xué)或其他尚未檢測(cè)到的變異造成的。

表 1.近5年EDA變異導(dǎo)致HED的臨床和分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)總結(jié)

 

圖2.EDA變異致HED的分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)匯總。a HED患者EDA 各變異域分布。b各 牙位EDA變異導(dǎo)致的牙齒保留率。c各EDA功能域變異導(dǎo)致的平均缺牙數(shù)。經(jīng)Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)， 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P  >0.5）。

WNT10A被認(rèn)為是 NSTA 中的常見致病基因，位于 2q35 染色體上。作為短程配體，WNT10A 局部激活受體介導(dǎo)的 WNT 信號(hào)通路?；蚪獯a發(fā)現(xiàn)，WNT10A 在牙齒發(fā)育過程中在牙上皮、牙釉質(zhì)結(jié)以及間充質(zhì)前成牙本質(zhì)細(xì)胞層中表達(dá)，并且是牙本質(zhì)發(fā)生和牙齒形態(tài)發(fā)生所必需的。 WNT10A 包含一個(gè)從殘基 1 到殘基 250 的 N 端食指結(jié)構(gòu)域 (NTD)，該結(jié)構(gòu)域具有 α 螺旋，以及一個(gè)從殘基 261 到殘基 338 的 C 端富含半胱氨酸的區(qū)域 (CTD)，該區(qū)域具有拇指。位于外顯子 3 的WNT10A c.511C > T (p.R171C) 和 c.637G > A (p.G213S) 是亞洲 NSTA 人群中常見的兩個(gè)變異。據(jù)報(bào)道，一名診斷為 NSTA 的男性存在復(fù)合雜合WNT10A變異 (c.511C > T 和 c.637G > A) 。臨床上他缺失兩顆牙齒，沒有任何外胚層發(fā)育不良的癥狀。這兩處變異均位于N端食指結(jié)構(gòu)域，靠近4個(gè)二硫鍵，氨基殘基的變異可能破壞二硫鍵結(jié)合，影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致N端食指結(jié)構(gòu)域不穩(wěn)定。目前尚無(wú)報(bào)道指出這兩種變異會(huì)導(dǎo)致HED，但據(jù)報(bào)道c.637G>A變異會(huì)導(dǎo)致輕微的ED癥狀。目前認(rèn)為，復(fù)合雜合WNT10A變異引起的牙齒脫落表型遠(yuǎn)比單個(gè)雜合WNT10A變異嚴(yán)重。

在基因解碼中，佳學(xué)基因檢測(cè)收集了同時(shí)存在EDA和WNT10A雙基因變異的 TA 病例（表2 ）。在之前關(guān)于WNT10A和EDA雙基因變異導(dǎo)致 TA 的基因解碼中，僅攜帶WNT10A和EDA雙基因變異的患者，其表型并不比之前報(bào)道的EDA單基因變異患者更嚴(yán)重。本基因解碼比較了一對(duì)親兄弟，可能排除了其他混雜因素的影響。佳學(xué)基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， WNT10A的兩個(gè)變異（c.511C > T 和 c.637G > A）的存在導(dǎo)致 HED 患者的牙齒缺失更為嚴(yán)重。

表 2.EDA和WNT10A雙基因變異的臨床和分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)總結(jié)

EDA/EDAR/NF-κB信號(hào)通路目前被認(rèn)為是與HED發(fā)病相關(guān)的經(jīng)典信號(hào)通路 ?；蚪獯a表明，EDA/EDAR/NF-κB信號(hào)通路與Wnt/β-catenin信號(hào)通路密切相關(guān)，且相互調(diào)控。在毛囊發(fā)育過程中，NF-κB激活需要Wnt/β-catenin信號(hào)，而EDAR/NF-κB隨后增強(qiáng)和維持Wnt/β-catenin活性。同時(shí)，在牙齒形態(tài)發(fā)生過程中，Wnt10A和EDAR均在起始和芽期的牙上皮以及帽期的釉結(jié)中表達(dá)。 Wnt 信號(hào)調(diào)節(jié)口腔外胚層中的外胚層發(fā)育異常蛋白的表達(dá)，而上皮信號(hào)中心的 EDAR 表達(dá)則對(duì) Wnt 誘導(dǎo)的鄰近外胚層外胚層發(fā)育異常蛋白作出反應(yīng)。作為 Wnt 信號(hào)抑制劑，Dkk4 是層形成過程中 EDA/EDAR 信號(hào)的直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)。已知 Lef-1 在 Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮作用。最近的基因解碼表明，Lef-1 和 β-catenin 的過表達(dá)顯著增加 EDA 轉(zhuǎn)錄，而內(nèi)源性 β-catenin 的間接穩(wěn)定則刺激 EDA 轉(zhuǎn)錄。WNT10A蛋白是 Wnt 配體家族的成員，可激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路。本基因解碼中，與弟弟相比，哥哥表現(xiàn)出了更多牙齒缺失的臨床表型。佳學(xué)基因檢測(cè)推測(cè)額外的WNT10A變異降低了突變型WNT10A與Wnt受體基因（FZD5）的結(jié)合力，導(dǎo)致NF-κB和Wnt信號(hào)通路同時(shí)受損，導(dǎo)致牙齒形態(tài)發(fā)生失敗。

 

(責(zé)任編輯：佳學(xué)基因)